Lymeská borrelióza je nejčastější klíšťaty přenášené onemocnění, jehož epidemiologická, klinická, ale také sociální závažnost v Evropě, USA a v dalších částech světa významně stoupá. Protože je borrelie významným patogenem člověka i zvířat, byla v posledních letech věnována stále větší pozornost základním otázkám biologie a ekologie původce tohoto onemocnění včetně molekulových mechanismů patogeneze s cílem proniknout do podstaty interakcí borrelií s jejich přenašeči i jejich definitivními hostiteli.
Borrelie patří do čeledi Spirochaetaceae, řád Spirochaetales. B. burgdorferi je pohyblivá, gramnegativní, dvojmembránová, spirálovitá patogenní bakterie, žijící extracelulárně. Borrrelia burgdorferi je dlouhá 20-30 µm a velmi tenká (0,2-0,25 µm). V periplazmatickém prostoru pod vnější povrchovou membránou jsou na obou koncích buňky ukotveny bičíky. Jejich počet se pohybuje od 7 do 11. Borrelia se obtížně kultivuje in vitro a vyžaduje speciální medium a mikroaerofilní pomínky. Dlouhodobá kultivace borrelií může vést ke ztrátě některých plasmidů, změnám v expresi proteinů a ke ztrátě schopnosti infikovat laboratorní zvířata.
V současné době existuje již poměrně dosti informací o druhovém složení komplexu Borrelia burgdorferi sensu lato. V rámci druhového komplexu dnes spolehlivě rozlišujeme jedenáct druhů (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. japonica, B. valaisiana, B. andersonii, B. lusitaniae, B. bissettii, B. tanukii, B. turdae, B. sinica). Z uvedených jedenácti "genomospecies" jsou B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii a B. valaisiana prokazatelně původci lymeské borreliózy. Druhy se liší geografickým rozšířením, přítomností různých kombinací plasmidů, skladbou antigenů, zastoupením strukturních složek a jejich funkčními aktivitami. V důsledku zmíněných molekulových odlišností existují také značné rozdíly v klinickém obrazu systémového onemocnění Lymeskou borreliózou.
Borrelia burgdorferi - modelový organismus molekulární parazitologie
Borrelia burgdorferi je jedním z organismů, u kterého je známa sekvence celého genomu. Genom bakterie Borrelia burgdorferi kmene B31 obsahuje lineární chromozom a minimálně 17 lineárních a cirkulárních plasmidů. Velikost chromosomu je 910 725 párů bazí a průměrný obsah G+C párů je 28,6 %. 853 předpokládaných kódujících sekvencí (ORF), má průměrnou velikost 992 bp, podobně, jako je tomu u jiných prokaryotických genomů. 93 % chromozomu reprezentují kódující sekvence. 59 % genů z celkového počtu 853 ORF byla připsána jejich biologická funkce, 12 % ORF je homologických s hypotetickými sekvencemi neznámé funkce z jiných organismů a 29 % ORF jsou nové geny. Průměrná molekulová hmotnost proteinů kódovaných na chromozomu je 37 529 (rozpětí od 3 369 do 254 242). Tyto hodnoty odpovídají pozorováním u jiných bakterií. Analýza kodonů ukázala, že je využíváno všech 61 tripletových kodonů. Nejčastějšími aminokyselinami jsou Ile (10,6 %), Leu (10,3%), Lys (10,2%), Ser (7,8%), Asn (7,2%). Vysoké hodnoty Lys korelují s průměrnou vypočítanou hodnotou izoelektrického bodu 9,7.
Chromozom obsahuje geny kódující proteiny zahrnuté v DNA replikaci, transkripci, translaci, transportu látek a energetickém metabolismu, ale neobsahuje geny pro biosyntézu látek.
Genom Borrelia burgdorferi (kmen B31), obsahuje kromě lineárního chromozomu ještě lineární a cirkulární plazmidy jejichž názvy a velikosti jsou shrnuty v následující tabulce:
| Lineární plazmidy | Cirkulární plazmidy | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Označení | Velikost (kbp) | Počet kopií v buňce | Označení | Velikost (kbp) | Počet kopií v buňce |
| lp56 | 56 | 1 | cp32 | 32 | 5-6 |
| lp54 | 54 | 1 | cp26 | 26 | 1 |
| lp49 | 49 | 1 | cp9 | 9 | 1 |
| lp38 | 38 | 1 | |||
| lp36 | 36 | 1 | |||
| lp28 | 28 | 4 | |||
| lp25 | 25 | 1 | |||
| lp17 | 17 | 1 | |||
Některé plazmidy se mohou ztrácet během kultivace (např. jeden lp28, jeden, nebo dva cp32).
Plazmidy obsahují celkem 430 předpokládaných ORF o průměrné velikosti 507 bp. Poměr G+C se pohybuje mezi 23,1-32,3 %. Pouze 71 % plazmidové DNA představuje předpokládané kódující sekvence, což je hodnota výrazně nižší, než v případě chromozomu. To naznačuje, že vzdálenosti mezi geny jsou větší u plazmidů, než na chromozomu, a že některé potencionální ORF obsahují posunutý čtecí rámec, nebo stop kodony. Z celkového počtu 430 ORF, pouze 76 (=16 %) bylo doposud identifikováno a patří mezi ně membránové proteiny, jako OspA-D, decorin binding proteiny atd. 100 ORF (23 %) je homologických s dalšími hypotetickými proteiny z plazmidů dalších příbuzných kmenů borrelií. 10 ORF (2,3 %) je homologických s hypotetickými proteiny z jiných rodů, než Borrelia. 250 ORF (58 %) nevykazuje žádné homologie s databází.
Geny kódované na plazmidech souvisejí většinou s virulencí a infektivitou, avšak biologická úloha většiny z nich není známá.
Malá velikost genomu borrelií je spojena se zřejmou absencí genů zahrnutých v syntéze aminokyselin, mastných kyselin, enzymových kofaktorů a nukleotidů.
Chromozom borrelií obsahuje 46 ORF a plazmidy obsahují 6 ORF, které kódují transportní proteiny. Produkty těchto genů tvoří 16 patrných membránových transportních proteinů pro aminokyseliny, cukry a ionty. Není zcela jasné, jakým způsobem může tak omezené množství přenašečů zastat různé fyziologické reakce. Několik popsaných přenašečů představuje širokou substrátovou specifitu, jako např. glycin, betain, L-prolin transportní systém (proVWX). Borrelie pravděpodobně kompenzuje svůj omezený kódující potenciál produkcí proteinů, které mohou importovat široké spektrum látek. Nebyly identifikovány žádné transportní systémy pro nukleosidy, nukleotidy, NAD/NADH a mastné kyseliny. Glukóza, fruktóza, maltóza a disacharidy jsou získávány systémem fosfoenolpyruvát:fosfotransferáza (PTS).
Pro borrelie je typická omezená metabolická výkonnost. Byly identifikovány všechny geny kódující enzymy glykolytického řetězce. Analýza metabolických drah naznačuje, že borrelie využívá glukózu, jako primární zdroj energie, ačkoliv ostatní sacharidy (karbohydráty), jako glycerol, glukosamin, fruktóza a maltóza mohou být též využity v glykolýze. Pyruvát produkovaný glykolýzou je přeměňován na laktát. Tvorba redukční síly probíhá oxidativní cestou pentózového cyklu. Žádné z genů kódujících proteiny Krebsova cyklu, nebo oxidativní fosforylace nebyly doposud identifikovány.
Přídavek N-acetylglukosaminu (NAG) do kultivačního média je potřebný pro růst borrelií. NAG je inkorporován do buněčné stěny a může rovněž sloužit jako zdroj energie. NAG je základní složka chitinu, který tvoří klíštěcí kutikulu a může být zdrojem cukrů pro borrelii, když je asociována s klíštětem. Borrelie může metabolizovat NAG na fruktóza-6-fosfát, který může být dále zužitkován v glykolýze.
Borrelia burgdorferi postrádá dýchací řetězec transportující elektrony, proto musí být dosaženo produkce ATP pomocí substrátové fosforylace. Geny pro ATP syntetázu se spíše podobají svojí velikostí a sekvenční podobností eukaryotickým ATP syntetázám, více než bakteriálním F1F0 ATP syntetázám.
Antigenní složení borrelií
V posledním desetiletí bylo věnováno značné úsilí identifikaci povrchových antigenů zodpovědných za vyvolání protektivní imunitní odpovědi proti borreliím, jakožto potencionálním kandidátům pro vývoj vakcíny a detekčních systémů. Imunizace proteiny OspA, OspB, OspC, nebo OspF zajišťuje efektivní ochranu zvířat v experimentu proti borreliím. Avšak geny kódující tyto proteiny jsou lokalizovány na plazmidech a vykazují vyšší stupeň sekvenční heterogenity, než geny kódované chromozomálně. Navíc stupeň exprese těchto antigenů může být redukován na úrovni transkripční regulace, nebo ztrátou plazmidů. Proto je vyvíjena snaha identifikovat chromozomálně kódovaný povrchový antigen, který bude poskytovat širokou ochranu.
Dále jsou studovány enzymové aktivity borrelií a vazebné aktivity strukturních složek zapojené v procesech rozpoznávání receptorů, případně dalších informačních molekul uplatňujících se v molekulových mechanismech patogeneze.
Nejlépe prostudovanými antigeny jsou povrchové proteiny vnější membrány označované OspA, -B, -C o velikostech molekul 31, 34 a 21-25 kDa. Geny pro OspA a OspB jsou umístěny na lineárním plazmidu 49 kb. Variabilita těchto dvou determinant je u evropských kmenů borrelií větší, než v Severní Americe. V mnoha případech jeden, nebo dokonce oba chybí v antigenní výbavě borrelií zcela a dominantním povrchovým proteinem je potom OspC, jehož gen se nachází na cirkulárním plazmidu 26 kb. OspC se vyskytuje jako dimer. Domény exponované na povrchu buňky jsou vysoce variabilní a podobají se variantnímu povrchovému glykoproteinu (VSG) Trypanosomy brucei. Další z povrchových antigenů B. burgdorferi lipoproteiny OspD (28 kDa, gen na lineárním plasmidu 38 kb), OspE, -F (19 a 26 kDa) či protein p27 byly identifikovány jako strukturní složky vnější membrány borrelií s různým stupněm exprese u jednotlivých izolátů a v závislosti na fázi životního cyklu borrelií.
Dalšími významnými antigeny jsou bičíkové proteiny borrelií. Bičík borrelií sestává ze dvou proteinů FlaA (37 kDa) a majoritního FlaB (41 kDa). Bylo prokázáno, že FlaA podléhá posttranslační glykosylaci. FlaA spouští časnou IgM protilátkovou imunitní odpověď u pacientů s Lymeskou borreliózou a bývá často využíván jako marker v diagnostických sadách.
Zásadním poznatkem z pohledu molekulových mechanismů patogeneze se jeví objev receptoru borrelií pro savčí plasminogen. Vazba plasminogenu na plasminogenový receptor zesiluje aktivaci plasminogenu savčími plasminogenovými aktivátory na aktivní plasmin. Plasmin je serinová proteáza se širokým spektrem účinků, která degraduje fibrin a nekolagenní proteiny extracelulární matrix a aktivuje latentní prokolagenázy, čímž napomáhá účinnému šíření spirochét uvnitř hostitele.
V poslední době byly identifikovány další dva povrchové lipoproteiny borrelií o velikosti 20 a 22 kDa jako strukturní jednotky receptoru pro dekorin, proteoglykan asociovaný na povrchu kolagenu. Bylo prokázáno, že dekorinový receptor funguje v experimentálních infekcích myší jako protektivní antigen.
Dalším studovaným antigenem je integrální membránový protein p66 (gen na chromozomu), jehož funkce zůstávala po dlouhou dobu nejasná. V nedávné době byl protein p66 identifikován jako ligand pro beta(3)-chain integriny. Byly identifikovány dva segmenty p66 důležité pro rozpoznání alpha(IIb)beta(3)integrinem. Alpha(IIb)beta(3)integrin je receptor na povrchu krevních destiček a normálně je zahrnut v procesu srážení krve. Exprese receptoru je podmíněná aktivací destiček a vazba spirochét byla pozorována pouze k aktivovaným destičkám.
Z dosavadních poznatků o povaze interakcí mezi bakteriálními patogeny a jejich receptory v hostitelských organismech vyplývá, že významnou skupinou molekul zapojujících se do procesů adherence jsou lektiny/aglutininy, proteiny se schopností vstupovat do nevazebných interakcí se sacharidovými složkami receptorových struktur. Během přenosu patogenních mikroorganismů vektory, jakož i při šíření infekce v organismu hostitele připadají v úvahu reciproké nevazebné interakce protein-sacharid. To tedy znamená, že se mohou uplatnit jak lektiny přenášeného patogenu specifické například pro sacharidové receptory vnitřních tkáňových systémů přenašeče, tak i opačně interakce tkáňově specifických lektinů přenašeče s cukernými složkami na cílových antigenech na povrchu patogenu. Práce vypracované na toto téma se zabývaly právě identifikací těchto sacharidových struktur (glykanů) u borrelií jako potenciálních receptorů pro interakci s tkáňově specifickými lektiny klíšťat.
Literatura
- Barbour AG, Hayes SF. (1986). Biology of Borrelia species. Microbiol Rev. 1986;50:381-400.
- Steere AC. Lyme disease. N. Engl. J. Med. 1989;321:586-97.
- Sharon N, Lis H. (1989). Lectins. Chapman and Hall 1989, 26-36.
- Saint Girons I, Old IG, Davidson BE. Molecular biology of the Borrelia, bacteria with linear replikons. Microbiology 1994;140:1803-16.
- Baranton G, Old IG. (1995). The spirochaetes: a different way of life. Bull Inst Pasteur. 1995;93:63-95.
- Fraser et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature 1997;390:580-6.
- Stanek G. Biology of Borrelia burgdorferi, Risk of infection with Lyme borreliosis. In: Tick borne encephalitis and Lyme borreliosis, Sus J, Kahl O. (Eds.), Pabst Scientific Publications Germany 1997, 230-7.